![]() |
- ⒶⒸГенная инженерия растений. Лабораторное руководство. [Djv- 4.9M] Сборник. Учебное издание. Авторы: Джон Дрейпер, Родерик Скотт, Филип Армитидж, Г. Дьюри, Л. Джэкоб, Р. Уолден, А. Кумар, Р. Джефферсон, Дж. Хэмил (J. Draper, R. Scott, Ph. Armitage, G. Dury, L. Jacob, R. Walden, A. Kumar, R. Jefferson, J. Hamil). Под редакцией Дж. Дрейпера, Р. Скотта, Ф. Армитиджа, Р. Уолдена. Перевод с английского Г.И. Эйснер, В.М. Андрианов, 1991.
(Москва: Издательство «Мир»: Редакция литературы по биологии, 1991)
Скан, обработка, формат Djv: АЧ, 2003
- ОГЛАВЛЕНИЕ:
Предисловие редактора перевода (5).
Предисловие (6).
Список авторов (8).
Список сокращений (9).
Глава 1. Агробактериальные трансформирующие векторы растений. Ф. Армитидж, Р. Уолден, Дж. Дрейпер (11).
1.1. Введение (11).
1.1.1. Индукция опухолей агробактерий (11).
1.1.2. Ti-плазмиды Agrobacterium tumefaciens (13).
1.1.3. Ri-плазмиды Agrobacterium rhizogenes (14).
1.1.4. Механизм переноса Т-ДНК (15).
1.1.5. Плазмиды агробактерий как векторы для трансформации (17).
1.1.6. Основные компоненты неонкогенных Ti-плазмидных векторов (18).
1.1.7. Неонкогенные векторы общего назначения на основе Ti-плазмид, используемые для трансформации растений (18).
1.1.8. Векторы для трансформации растений с помощью A. rhizogenes (26).
1.1.9. Использование специальных трансформирующих векторов на основе Ti-плазмид (27).
1.1.10. Выбор Ti-плазмидной векторной системы агробактерий (29).
1.1.11. Клонирование в векторах для трансформации растений (35).
1.2. Общие молекулярно-биологические рекомендации (37).
1.3. Культивирование и хранение бактериальных штаммов (39).
1.3.1. Обеспечение (39).
1.3.2. Наращивание ночных бактериальных культур (40).
1.3.3. Рассев бактериальных культур для получения отдельных колоний (40).
1.3.4. Длительное хранение бактериальных штаммов (41).
1.3.5. Приготовление чашек для селекции бактерий (41).
1.4. Препаративное выделение плазмид из Е. coli в больших объемах (42).
1.4.1. Основные положения (42).
1.5. Выделение и очистка рестрикционных фрагментов ДНК для лигирования (49).
1.5.1. Основные положения (49).
1.5.2. Очистка фрагментов ДНК после гидролиза рестриктазами (40).
1.5.3. Удаление 5' -фосфатных групп фрагментов ДНК с помощью фосфатазы из кишечника теленка (50).
1.5.4. Электроэлюция рестрикционных фрагментов из агарозных гелей (51).
1.5.5. Очистка специфических рестрикционных фрагментов путем фильтрования центрифугированием (53).
1.6. Лигирование фрагментов ДНК с векторами для трансформации растений (54).
1.6.1. Основные положения (54).
1.6.2. Обеспечение (58).
1.6.3. Методика (модифицировано по) (59).
1.7. Введение рекомбинантных плазмид в клетки Е. coli с помощью трансформации (61).
1.7.1. Основные положения (61).
1.7.2. Обеспечение (63).
1.7.3. Методика (64).
1.8. Быстрое выделение небольших количеств плазмидной ДНК Е. coli (67).
1.8.1. Основные положения (67).
1.8.2. Обеспечение (69).
1.8.3. Методика (модифицировано по) (70).
1.9. Анализ мини-препаратов ДНК с помощью рестрикционного гидролиза и электрофореза в агарозиом геле (71).
1.9.1. Основные положения (71).
1.10. Конъюгационный перенос рекомбинантных плазмид в агробактерии (72).
1.10.1. Основные положения (72).
1.10.2. Обеспечение (74).
1.10.3. Методика (75).
1.11. Выделение тотальных препаратов нуклеиновых кислот из A. tumefaciens (76).
1.11.1. Основные положения (76).
1.11.2. Обеспечение (76).
1.11.3. Методика (модифицирована по) (77).
1.12. Рестрикционный гидролиз тотальной ДНК агробактерий (78).
1.12.1. Основные положения (78).
Приложение 1 [I] (80).
Обычное оборудование для молекулярно-биологических исследований (80).
Приложение 1 [II] (82).
А. Используемые в примерах бактериальные штаммы (82).
Б. Антибиотики, используемые для селекции бактерий (82).
Литература (83).
Глава 2. Трансформация клеток двудольных растений с помощью Ti-плазмид Agrobacterium tumefacieris и Ri-плазмид A. rhizogenes. Дж. Дрейпер, Р. Скотт, Дж. Хэмил (87).
2.1. Введение (87).
2.1.1. Основные свойства агробактерий и векторов, которые используются для трансформации клеток растений (88).
2.1.2. Поведение культивируемых растительных клеток, влияющее на их трансформацию агробактериями (92).
2.1.3. Селекция трансформированных тканей и регенерация растений (95).
2.1.4. Основные методы трансформации растительных клеток с помощью агробактериальных векторов (103).
2.2. Трансформация с помощью онкогенных штаммов дикого типа A. tumfaciens и A. rhizogenes (105).
2.2.1. Основные положения (105).
2.2.2. Обеспечение (110).
2.2.3. Методика (111).
2.3. Трансформация больших гетерогенных эксплантатов с помощью неонкогенных Ti-плазмидных векторов (117).
2.4. Прямая регенерация трансформированных растений: трансформация листовых дисков табака (119).
2.4.1. Основные положения (119).
2.4.2. Обеспечение (121).
2.4.3. Методика (122).
2.5. Регенерация трансформированных растений через стадию каллуса: трансформация эксплантатов проростков льна (130).
2.5.1. Основные положения (130).
2.5.2. Получение стерильных проростков льна и регенерация из эксплантатов проростков льна (132).
2.5.3. Трансформация гипокотилей, регенерация из трансформированного каллуса, селекция, размножение и укоренение трансформированных побегов (135).
2.6. Трансформация малых гомогенных эксплантатов (140).
2.6.1. Основные положения (140).
2.6.2. Разработка систем совместного культивирования (141).
2.7. Выделение мезофильных протопластов табака (143).
2.7.1. Основные положения (143).
2.7.2. Обеспечение (145).
2.7.3. Методика (146).
2.8. Культивирование мезофильных протопластов табака (149).
2.8.1. Основные положения (149).
2.8.2. Обеспечение (150).
2.8.3. Методика (150).
2.9. Трансформация протопластов путем совместного культивирования с агробактериями (151).
2.9.1. Основные положения (151).
2.9.2. Обеспечение (152).
2.9.3. Методика (153).
2.10. Трансформация клеток суспензионной культуры моркови (160).
2.10.1. Основные положения (160).
2.10.2. Инициация проэмбриогенных суспензионных клеточных культур моркови, приготовление фидерных чашек и высев на переносные диски (165).
2.10.3. Инокуляция клеток моркови агробактериями, селекция трансформантов и регенерация путем соматического эмбриогенеза (167).
Приложение 2 [I] (170).
Обычные материалы для работы с культурой тканей (170).
Приложение 2 [II] (171).
Среда для культуры растительных клеток и тканей (171).
Приложение 2 [III] 175.
Антибиотики, добавляемые в среды для культур растительных клеток (175).
Приложение 2 [IV] (176).
Подготовка эксплантатов для инокуляции агробактериями (176).
Приложение 2 [V] (178).
Растворы для выделения протопластов табака (178).
Приложение 2 [VI] (179).
Выделение протопластов из измельченных кусочков листа (179).
Приложение 2 [VII] (180).
Методы флуоресцентного окрашивания для контроля развития растительных протопластов (180).
Приложение 2 [VIII] (181).
Примеры процедур генетической трансформации растений, основанных на системе переноса генов агробактерий (181).
Литература (181).
Глава 3. Трансформация растительных клеток путем трансфекции ДНК. Дж. Дрейпер, Р, Скотт, А. Кумар, Г. Дьюри (194).
3.1. Введение (194).
3.1.1. Ограничения системы трансформации с помощью агробактерий (194).
3.1.2. Трансформация растительных протопластов изолированной векторной ДНК (196).
3.1.3. Разработка стратегий трансформации протопластов путем трансфекции ДНК (197).
3.1.4. Векторы для переноса генов посредством ДНК (DMGT-векторы) (199).
3.1.5. Трансформация интактных растительных тканей DMGT-векторами (201).
3.2. Трансфекция протопластов с помощью полиэтиленгликоля (203).
3.2.1. Основные положения (203).
3.2.2. Стимулируемое ПЭГ поглощение ДНК протопластами (205).
3.2.3. Выделение ДНК из протопластов и дот-блоттинг-гибридизация (206).
3.3. Трансформация протопластов с помощью электропорации (212).
3.3.1. Основные положения (212).
3.3.2. Оптимизация методик электропорации с помощью временной экспрессии (216).
3.4. Трансформация растительных клеток путем микроинъекций (221).
3.4.1. Основные положения (221).
3.4.2. Трансформация растений путем микроинъекций (223).
Приложение 3 [I] (232).
Выделение протопластов из клеток суспензионной альбинотической культуры Petunia hybrida (сорт Blue Lace) (232).
Литература (232).
Глава 4. Выделение нуклеиновых кислот из клеток растений. Дж. Дрейпер, Р. Скотт (236).
4.1. Введение (236).
4.1.1. Выделение ДНК (236).
4.1.2. Выделение РНК (238).
4.2. Выделение тотальной ДНК из лиофилизированных тканей растений (239).
4.2.1. Общие положения (239).
4.2.2. Выделение небольших количеств ДНК с помощью СТАВ-буфера (241).
4.2.3. Выделение ДНК с помощью протеиназы (245).
4.3. Выделение ДНК из свежего растительного материала (248).
4.3.1. Общие положения (248).
4.3.2. Выделение больших количеств тотальной ДНК из свежего растительного материала с помощью СТАВ-буфера (249).
4.3.3. Выделение ДНК из свежих тканей с помощью ДСН (249).
4.3.4. Выделение ДНК из свежих тканей с помощью ДСН и протеиназы К (252).
4.4. Выделение ядерной ДНК (254).
4.4.1. Выделение ядерной ДНК из свежих каллусов или листьев (254).
4.4.2. Выделение ядерной ДНК из протопластов (257).
4.5. Выделение ДНК из хлоропластов и митохондрий (258).
4.5.1. Общие положения (258).
4.5.2. Обеспечение (259).
4.5.3. Методика (260).
4.6. Определение концентрации ДНК в неочищенных препаратах нуклеиновых кислот с помощью дифениламина (262).
4.6.1. Общие положения (262).
4.6.2. Обеспечение (263).
4.6.3. Методика (264).
4.7. Выделение тотальной РНК из растений (265).
4.7.1. Общие положения (265).
4.7.2. Фенольный метод выделения тотальной РНК из растений (265).
4.7.3. Метод выделения тотальной РНК из растений при помощи хлористого лития (269).
4.8. Выделение poly(A)+-мРНК (270).
4.8.1. Общие положения (270).
4.8.2. Обеспечение (271).
4.8.3. Методика (272).
Приложение 4 [I] (273).
Выделение больших количеств тотальной ДНК из клеток растений с помощью СТАВ (273).
Приложение 4 [II] (274).
Очистка ДНК из растений в градиентах CsCl/БЭ (274).
Литература (276).
Глава 5. Анализ ДНК путем рестрикции и гибридизации по Саузеруу. Р. Скотт (277).
5.1. Введение (277).
5.2. Обработка ДНК ферментами рестрикции (278).
5.2.1. Общие положения (278).
5.2.2. Обеспечение (279).
5.2.3. Методика (279).
5.3. Фракционирование ДНК методом электрофореза в агарозиом геле (280).
5.3.1. Общие положения (280).
5.3.2. Обеспечение (281).
5.3.3. Методика (282).
5.4. Блоттинг по Саузерну обработанных рестриктазами и разделенных фрагментов ДНК (287).
5.4.1. Общие положения (287).
5.4.2. Обеспечение (288).
5.4.3. Методика (289).
5.5. Гибридизация ДНК, перенесенной на мембраны с помощью блоттннга по Саузерну (293).
5.5.1. Общие положения (293).
5.5.2. Обеспечение (293).
5.5.3. Методика (295).
5.6. Мечение препаратов для гибридизации с помощью олигонуклеотидной затравки (297).
5.6.1. Общие положения (297).
5.6.2. Обеспечение (298).
5.6.3. Методика (299).
Приложение 5 [I] (301).
Буферы для рестриктаз (301).
Приложение 5 [II] (302).
Концевое мечение маркеров, полученных на основе ДНК фага X (302).
Приложение 5 [III] (302).
Определение включения метки в ДНК (302).
Литература (303).
Глава 6. Анализ организации и экспрессии генов растений. Р. Скотт, Дж. Дрейпер, Р. Джефферсон, Г. Дьюри, Л. Джэкоб (304).
6.1. Введение (304).
6.1.1. Принцип организации генов растений (304).
6.1.2. Строение мРНК (306).
6.1.3. Перенос продуктов генов в клетке (306).
6.1.4. Использование генетической трансформации для изучения экспрессии генов растений (307).
6.1.5. Использование трансгенных растений для изучения последовательностей, регулирующих транскрипцию (308).
6.1.6. Изучение регуляторных последовательностей с помощью индикаторных генов (308).
6.2. Изучение организации Т-ДНК методом блоттинг-гибридизации по Саузерну (311).
6.2.1. Общие положения (311).
6.2.2. Организация последовательностей чужеродной ДНК в тканях растений (313).
6.2.3. Изучение организации Т-ДНК в трансгенных растениях моркови методом блоттинг-гибридизации (317).
6.3. Анализ экспрессии генов методом точечного нозерн-блоттинга (324).
6.3.1. Регуляция транскрипции гена Cab в этиолированном растении гороха под действием фитохрома (325).
6.4. Использование CAT в качестве индикаторного гена для изучения контроля экспрессии генов в различных органах и при изменении условий среды (331).
6.4.1. Общие положения (331).
6.4.2. Определение активности хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT) (333).
6.4.3. Примеры использования cat в качестве индикаторного гена для изучения контроля экспрессии гена Cab-cat в различных органах и в зависимости от условий среды (336).
6.5. Применение неомицинфосфотрансферазы-II (NPT-II) в качестве индикаторного белка для изучения роли последовательностей, участвующих в переносе белков (транзитных пептидов) (340).
6.5.1. Общие положения (340).
6.6. Выделение интактных хлоропластов табака (343).
6.6.1. Общие положения (343).
6.6.2. Обеспечение (344).
6.6.3. Методика (345).
6.7. Определение активности NPT-II in situ (346).
6.7.1. Общие положения (346).
6.7.2. Неденатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле (347).
6.7.3. Определение NPT-II in situ после электрофореза (352).
6.8. Определение NPT-II методом вестерн-блоттинга (357).
6.8.1. Общие положения (357).
6.9. Получение химерных генов с последовательностями, кодирующими индикаторный фермент: система слияния с геном GUS (362).
6.9.1. Общие положения (363).
6.9.2. Слияние с геном GUS (364).
6.9.3. Определение активности GUS в экстрактах растений (366).
6.9.4. Выделение GUS из тканей растений (366).
6.9.5. Флуориметрическое определение активности GUS (368).
6.9.6. Выявление GUS in situ с использованием денатурирующего полиакриламидного геля (371).
6.9.7. Гистохимическое выявление GUS на срезах тканей растений (374).
6.10. Определение нопалина в трансформированных растительных тканях (377).
6.10.1. Общие положения (377).
6.10.2. Обеспечение (378).
6.10.3. Методика (379).
Приложение 6 [I] (383).
Нозерн-блоттинг (383).
Приложение 6 [II] (385).
Выделение NPT-II и CAT из бактерий (385).
Приложение 6 [III] (386).
Определение концентрации белка по Бредфорду (386).
Приложение 6 [IV] (386).
Определение агропина и маниопина (386).
Литература (387).
Список фирм, поставщиков реактивов и оборудования (391).
Предметный указатель (395).
Указатель латинских названий (398).
Указатель методик (400).
ИЗ ИЗДАНИЯ: Сборник методов по генетической трансформации растений и анализу экспрессии генов написан английскими специалистами. Подробное обсуждение теоретических основ методов и четкость изложения практического материала позволяют рекомендовать книгу в качестве руководства для начинающих исследователей.
Для молекулярных биологов и генетиков растений. |
![]() |
